Plásmido CRISPR de Activación (m) CDKN2A/p16: sc-419610-ACT

El gen Cdkn2a de ratón codifica el supresor tumoral CDKN2A/p16, un inhibidor de quinasas dependientes de ciclina que restringe la actividad de CDK4/6 para mantener a RB1 en su estado hipofosforilado e imponer el punto de control G1/S. Al limitar la transcripción impulsada por E2F, p16 integra las señales proliferativas con programas de detención del ciclo celular y se activa con frecuencia durante la senescencia replicativa y las respuestas al estrés inducido por oncogenes. La desregulación del locus Cdkn2a está estrechamente vinculada a la proliferación aberrante y a estados de senescencia alterados, lo que lo convierte en un nodo central en estudios del control del ciclo celular, fenotipos asociados al envejecimiento y biología del cáncer en modelos murinos.

CDKN2A/p16 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cdkn2a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CDKN2A/p16 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cdkn2a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cdkn2a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CDKN2A/p16. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cdkn2a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CDKN2A/p16 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CDKN2A/p16 en células tumorales con expresión de Cdkn2a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.