Plasmide CRISPR d'Activation (m) Cdk8: sc-435217-ACT

La kinase 8 dépendante des cyclines (Cdk8) est une kinase associée au complexe Mediator qui régule la transcription dépendante de l’ARN polymérase II en intégrant des signaux de signalisation avec l’activité des promoteurs et des enhancers. Dans les cellules murines, CDK8 module des programmes transcriptionnels en aval de voies telles que Wnt/β-caténine, TGF-β et MAPK, influençant la prolifération, la différenciation et l’expression de gènes induits par le stress. Par la phosphorylation de régulateurs transcriptionnels et de sous-unités de Mediator, CDK8 agit sur le contrôle du cycle cellulaire et les décisions de destinée cellulaire au cours du développement et de l’homéostasie tissulaire. Une activité dérégulée de CDK8 a été associée à des états transcriptionnels altérés liés à la signalisation oncogénique et aux processus inflammatoires, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la régulation génique et des interactions entre voies de signalisation.

Cdk8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cdk8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cdk8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cdk8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cdk8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cdk8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cdk8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cdk8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cdk8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cdk8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.