CD92 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408392-ACT

SLC44A1 codifica CD92, una proteina di membrana di tipo “choline transporter-like” che contribuisce all’assorbimento cellulare di colina e al metabolismo dei fosfolipidi, sostenendo le esigenze di biogenesi di membrana e di segnalazione nelle cellule proliferanti. Influenzando la disponibilità di colina, CD92 è collegata a vie che regolano la sintesi della fosfatidilcolina, l’omeostasi delle membrane degli organelli e risposte più ampie allo stress associate ai lipidi. Alterazioni dell’espressione o della regolazione dei componenti del trasporto della colina sono state associate al rimodellamento metabolico osservato nella biologia del cancro e a perturbazioni in contesti neuroimmuni e infiammatori, rendendo SLC44A1 un nodo utile per studi meccanicistici sul metabolismo dei lipidi di membrana. La localizzazione di CD92 e la sua attività di trasporto forniscono inoltre un readout facilmente utilizzabile per indagare come il trasporto di nutrienti si interfacci con i programmi di crescita e differenziamento cellulare.

CD92 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC44A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD92 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC44A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC44A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD92. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC44A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD92 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD92 nelle cellule tumorali con espressione di SLC44A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.