CD137 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405068-ACT

TNFRSF9 kodiert CD137 (4-1BB), einen induzierbaren kostimulatorischen Rezeptor der TNF-Rezeptor-Superfamilie, der überwiegend auf aktivierten T‑Zellen und weiteren Immunzellsubtypen exprimiert wird. Nach Ligandenbindung signalisiert CD137 über TRAF-Adapterproteine und aktiviert die kanonischen und nicht-kanonischen NF‑κB-, MAPK- sowie PI3K/AKT-Signalwege, was Zellüberleben, Zytokinproduktion und eine anhaltende Effektorfunktion fördert. Die CD137-abhängige Signalübertragung prägt Programme der Immunaktivierung und -toleranz und beeinflusst die Expansion von T‑Zellen, die Gedächtnisbildung sowie die Interaktionen mit antigenpräsentierenden Zellen. Eine fehlregulierte TNFRSF9/CD137-Aktivität wurde mit immunvermittelten Entzündungen und veränderten Tumor-Immunmikromilieus in Verbindung gebracht und stellt damit einen nützlichen molekularen Ansatzpunkt für mechanistische Studien zur Immunregulation dar.

CD137 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD137 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD137-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD137-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD137-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.