calsequestrin 2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419472-ACT

Mouse Casq2 kodiert Calsequestrin 2, ein luminales Protein des sarkoplasmatischen Retikulums mit hoher Ca2+-Bindekapazität, das als Puffer wirkt und Ca2+-Speicher organisiert, um die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung zu unterstützen. Indem CASQ2 das Verhalten des Ryanodinrezeptor‑Kanals (RYR2) und die Kinetik der Ca2+-induzierten Ca2+-Freisetzung beeinflusst, wirkt es auf das Ca2+-Cycling, die Refraktärzeit des SR und die kontraktile Stabilität der Myozyten ein. Störungen der CASQ2-abhängigen Ca2+-Homöostase werden mit stressinduzierten arrhythmogenen Mechanismen und veränderten Programmen der intrazellulären Ca2+-Signalübertragung in Verbindung gebracht, wodurch Casq2 einen zentralen Knotenpunkt in der kardialen Elektrophysiologie sowie der Forschung zur Ca2+-Handhabung darstellt. In Modellsystemen wird die Modulation von Casq2 häufig eingesetzt, um die SR‑Ca2+-Pufferung, die Dynamik von Ca2+-Sparks und nachgeschaltete Signalantworten auf gestörte Ca2+-Flüsse zu untersuchen.

calsequestrin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Casq2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

calsequestrin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Casq2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Casq2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen calsequestrin 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Casq2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von calsequestrin 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des calsequestrin 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Casq2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.