Plásmido CRISPR de Activación (m2) Calnexin: sc-419436-ACT-2

El gen Canx de ratón codifica la calnexina, una chaperona de membrana del retículo endoplásmico (RE) que se une a glicanos N‑ligados monoglucosilados para promover el plegamiento, el ensamblaje y la retención de glicoproteínas nacientes dentro del ciclo calnexina/calreticulina. La calnexina participa en el control de calidad del RE y en la proteostasis al coordinarse con ERp57 y otras oxidorreductasas relacionadas, influyendo en la formación de puentes disulfuro, la degradación asociada al RE (ERAD) y la respuesta a proteínas mal plegadas durante el estrés del RE. La alteración de la vigilancia del plegamiento dependiente de Canx puede perturbar la homeostasis de la vía secretora y se ha asociado con fenotipos relevantes para el neurodesarrollo, la mielinización y la función inmunitaria en modelos murinos en los que la maduración de glicoproteínas es crítica. La edición genética de Canx facilita estudios mecanísticos sobre la biogénesis de glicoproteínas, la señalización de estrés del RE y el tráfico de proteínas de membrana y secretadas en distintos tipos celulares y en contextos relevantes para enfermedades.

Calnexin El plásmido de activación CRISPR (m2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Canx sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Calnexin El plásmido de activación CRISPR (m2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Canx en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Canx, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Calnexin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Canx y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Calnexin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Calnexin en células tumorales con expresión de Canx silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.