Calnexin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400154-ACT

Il gene umano **CANX** codifica la calnexina, una chaperone lectinica di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che riconosce glicani N-linked monoglucosilati e favorisce il corretto ripiegamento e il controllo qualità delle glicoproteine nascenti. La calnexina opera nel ciclo calnexina/calreticulina insieme a ERp57 ed enzimi di processamento delle glicoproteine per coordinare la formazione dei ponti disolfuro, la ritenzione nel RE e la degradazione associata al RE (ERAD) dei substrati ripiegati in modo scorretto. Grazie al suo ruolo centrale nella proteostasi, CANX è collegato alla segnalazione della risposta alle proteine non ripiegate (unfolded protein response), all’omeostasi del calcio nel RE e alla regolazione del flusso nella via secretoria. Alterazioni della capacità di ripiegamento dipendente dalla calnexina sono state associate a fenotipi di stress cellulare e a meccanismi rilevanti per la patologia che coinvolgono misfolding proteico e traffico aberrante.

Calnexin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CANX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calnexin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CANX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CANX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calnexin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CANX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calnexin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calnexin nelle cellule tumorali con espressione di CANX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.