C/EBP α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400195-ACT

CEBPA kodiert den Transkriptionsfaktor C/EBPα, ein basisches Leucin-Zipper-Protein, das die Linienfestlegung und die terminale Differenzierung reguliert, insbesondere in granulopoetischen und adipogenen Programmen. Durch Bindung an CCAAT/Enhancer-Motive koordiniert C/EBPα transkriptionelle Netzwerke, die Zellzyklushemmung, die Expression metabolischer Gene und die myeloide Reifung steuern, mit funktionellen Überschneidungen zu Zytokin-Signalwegen und chromatinregulatorischen Pfaden. Eine veränderte CEBPA-Expression oder Mutationen sind häufig mit einer gestörten Hämatopoese und Differenzierungsblock-Phänotypen verknüpft, weshalb CEBPA ein viel untersuchter Knotenpunkt in der transkriptionellen Kontrolle der myeloiden Identität ist. Diese Eigenschaften machen C/EBPα zu einem geeigneten Modellsystem, um Dosiseffekte von Transkriptionsfaktoren, Enhancer-Logik und Übergänge zwischen Differenzierungszuständen in humanen Zellen zu untersuchen.

C/EBP α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CEBPA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

C/EBP α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CEBPA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CEBPA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen C/EBP α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CEBPA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von C/EBP α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des C/EBP α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CEBPA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.