BUB3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402439-ACT

BUB3 codifica una proteina cardine del checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC) che si localizza ai cinetocori e contribuisce a monitorare l’aggancio dei microtubuli durante la mitosi. Interagendo con BUB1 e contribuendo al complesso del checkpoint mitotico, BUB3 frena l’inizio dell’anafase attraverso la regolazione dell’attività di APC/C e supporta una corretta segregazione dei cromosomi. L’alterazione della segnalazione del checkpoint associata a BUB3 può favorire instabilità cromosomica e aneuploidia, processi frequentemente analizzati negli studi sulla tumorigenesi e sul mantenimento del genoma. Di conseguenza, BUB3 è ampiamente utilizzato come punto di ingresso meccanicistico per indagare la fedeltà mitotica, la segnalazione del cinetocoro e le risposte allo stress dipendenti dal ciclo cellulare nelle cellule umane.

BUB3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BUB3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BUB3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BUB3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BUB3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BUB3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BUB3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BUB3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BUB3 nelle cellule tumorali con espressione di BUB3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.