BTG4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408621-ACT

BTG4 (B-cell Translocation Gene 4) kodiert ein antiproliferatives Protein der BTG/Tob-Familie, das an der Regulation des mRNA-Stoffwechsels und transkriptioneller Programme beteiligt ist, die den Verlauf des Zellzyklus und die Differenzierung prägen. In humanen Zellen wird BTG4 mit der Kontrolle der Deadenylierung mütterlicher mRNAs und der translationalen Repression in Verbindung gebracht und koppelt damit posttranskriptionelle Genregulation an Entwicklungszeitpunkte und Zellschicksalsübergänge. Über Interaktionen mit Komponenten der CCR4–NOT-Deadenylase und verwandten RNA-regulatorischen Faktoren kann BTG4 die globale Stabilität von Transkripten und die Proteomausgabe beeinflussen – Prozesse, die bei onkogener Transformation häufig gestört sind. Eine veränderte Aktivität von BTG-Familienmitgliedern ist mit einer Fehlregulation von Wachstumskontrolle und Stressantwort-Signalwegen assoziiert, was BTG4 zu einem relevanten Knotenpunkt für mechanistische Studien zu Proliferation, Differenzierung und RNA-Umsatz macht.

BTG4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BTG4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BTG4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BTG4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BTG4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BTG4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BTG4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BTG4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BTG4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BTG4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.