brevican CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402668-ACT

BCAN kodiert Brevican, ein Chondroitinsulfat-Proteoglykan, das in der extrazellulären Matrix des Gehirns und in perineuronalen Netzen angereichert ist und dort Zell–Matrix-Interaktionen sowie die strukturelle Plastizität von Synapsen moduliert. Brevican bindet Hyaluronan und interagiert mit Tenascin-R und anderen Matrixbestandteilen, wodurch es die Assemblierung der extrazellulären Matrix, neuronale Adhäsion und das Auswachsen von Neuriten beeinflusst. Durch die Regulation der perizellulären Matrixorganisation und ein proteasesensitives Remodeling trägt BCAN zu Prozessen bei, die mit der Neuroentwicklung und der aktivitätsabhängigen Feinabstimmung neuronaler Schaltkreise verknüpft sind. Eine veränderte Expression und Prozessierung von Brevican wurde in neurologischen und neuropsychiatrischen Kontexten beschrieben und wird in der Gliombiologie und bei invasiven Phänotypen häufig als matrixassoziierter Faktor untersucht.

brevican Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BCAN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

brevican Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BCAN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BCAN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen brevican-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BCAN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von brevican-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des brevican-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BCAN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.