Plásmido CRISPR de Activación (h) brachyury: sc-416539-ACT

El gen T humano codifica la braquiuria, un factor de transcripción de la familia T-box que es esencial para la especificación del mesodermo, la formación de la notocorda y el desarrollo del eje posterior. La braquiuria regula programas de linaje uniéndose a motivos T-box y coordinando redes transcripcionales que se interconectan con procesos asociados a la EMT, la migración celular y vías de señalización de patrón del desarrollo. En contextos adultos, la desregulación de la expresión de T se ha vinculado a estados de diferenciación alterados y a la reprogramación transcripcional observada en múltiples tipos de tumores y en el cordoma, donde la braquiuria se estudia con frecuencia como marcador asociado al linaje y como impulsor. Como regulador del desarrollo, la braquiuria constituye un nodo accesible para investigar circuitos de regulación génica que controlan las transiciones epitelio–mesénquima y las decisiones de destino mesodérmico en modelos celulares humanos.

brachyury El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de T sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

brachyury El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus T en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional T, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de brachyury. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo T y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de brachyury en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía brachyury en células tumorales con expresión de T silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.