Plásmido CRISPR de Activación (h2) beta Actin: sc-400000-ACT-2

El gen humano ACTB codifica la beta-actina, una proteína del citoesqueleto altamente conservada que se polimeriza en microfilamentos para mantener la forma celular, la polaridad, la contractilidad y la motilidad. La dinámica de la beta-actina es fundamental en las vías de remodelación del citoesqueleto de actina que coordinan el recambio de las adhesiones focales, la mecanotransducción, la citocinesis y el tráfico vesicular, y también contribuye a la regulación transcripcional mediante procesos nucleares dependientes de actina. La alteración de ACTB o de sus redes de interacción se asocia con trastornos del desarrollo y con una organización citoesquelética modificada observada en la invasión y metástasis de células cancerosas, lo que subraya su utilidad para estudiar relaciones genotipo–fenotipo. Los flujos de trabajo de edición génica dirigida a ACTB y de genómica funcional se emplean habitualmente para investigar la señalización regulada por actina, cuantificar fenotipos citoesqueléticos mediante imagen en células vivas y establecer contextos de referencia sólidos para estudios de perturbación de vías.

beta Actin El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ACTB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

beta Actin El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ACTB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ACTB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de beta Actin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ACTB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de beta Actin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía beta Actin en células tumorales con expresión de ACTB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.