BECN1/Beclin-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425033-ACT

Das Mausgen **Becn1** kodiert **BECN1/Beclin-1**, ein zentrales Gerüstprotein des Klasse-III-Phosphatidylinositol-3-Kinase-Komplexes, der die Initiierung der Autophagie und die Nukleation von Autophagosomen reguliert. Durch Interaktionen mit **VPS34/PIK3C3**, **ATG14**, **UVRAG** und Proteinen der **BCL2-Familie** koordiniert BECN1 den autophagischen Fluss, den endolysosomalen Transport sowie zelluläre Antworten auf Nährstoffstress. Die von BECN1 vermittelte Regulation der Proteostase und der Qualitätskontrolle von Organellen verknüpft diesen Signalweg mit Neurodegeneration, Infektionsbiologie, Tumorzellmetabolismus und inflammatorischer Signalgebung. Als Knotenpunktregulator der Autophagie wird BECN1/Beclin-1 häufig im Hinblick auf seine Effekte auf Überlebenssignalwege, mitochondriale Homöostase und stressadaptive Transkriptionsprogramme untersucht.

BECN1/Beclin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Becn1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BECN1/Beclin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Becn1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Becn1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BECN1/Beclin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Becn1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BECN1/Beclin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BECN1/Beclin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Becn1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.