B7-2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419575-ACT

Maus-*Cd86* kodiert das kostimulatorische Protein der Immunglobulin-Superfamilie B7-2, einen Oberflächenliganden auf antigenpräsentierenden Zellen, der an CD28 und CTLA-4 bindet und so T‑Zell-Aktivierung, -Proliferation und Zytokinproduktion feinabstimmt. B7-2 ist an der Bildung der immunologischen Synapse beteiligt und wirkt mit der Antigenrezeptor-Signalgebung zusammen, um adaptive Immunantworten zu prägen, einschließlich Th-Polarisierung und Toleranzmechanismen. Eine veränderte CD86-Expression wird häufig als Indikator für die Aktivierung von dendritischen Zellen und Makrophagen verwendet und ist über die Modulation von Checkpoint-Signalwegen an der Biologie entzündlicher und autoimmuner Erkrankungen sowie der Tumorimmunologie beteiligt.

B7-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cd86-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

B7-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cd86-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cd86-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen B7-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cd86-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von B7-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des B7-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cd86-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.