ATP6E CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404046-ACT

Das humane ATP6V1E1 kodiert die E1-Untereinheit (ATP6E) der peripheren V1-Domäne der vakuolären H+-ATPase (V-ATPase), einer aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protonenpumpe, die die ATP-abhängige Ansäuerung von Endosomen, Lysosomen, Golgi-Apparat und sekretorischen Vesikeln antreibt. Durch die Regulierung des pH-Werts von Organellen unterstützt die V-ATPase die rezeptorvermittelte Endozytose, den Autophagie-Lysosomen-Flux, die Proteostase sowie Nährstoff-Signalwege einschließlich der mTORC1-Signalgebung an der Lysosomenoberfläche. Die von ATP6V1E1 abhängige Ansäuerung beeinflusst zudem die Antigenprozessierung, den Membrantransport und die Aktivität pH-sensitiver Enzyme und verknüpft das Gen damit mit grundlegenden Mechanismen der zellulären Homöostase. Eine dysregulierte V-ATPase-Funktion ist mit verändertem vesikulärem Transport und lysosomaler Dysfunktion assoziiert, wie sie in einer Reihe krankheitsrelevanter zellulärer Phänotypen beobachtet wird, darunter Kontexte der Neuroentwicklung und des metabolischen Stresses.

ATP6E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V1E1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATP6E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V1E1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V1E1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATP6E-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V1E1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATP6E-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATP6E-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V1E1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.