Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP13A2: sc-404770-ACT

ATP13A2 code une ATPase lysosomale de type P5 impliquée dans le maintien de l’homéostasie endolysosomale, notamment la fonction de la membrane lysosomale, la gestion des cations et des polyamines, ainsi que le trafic vésiculaire. En soutenant le contrôle qualité dépendant des lysosomes, ATP13A2 influence le flux autophagie–lysosome et les voies de protéostasie, qui recoupent les réponses au stress mitochondrial et les dommages oxydatifs. La perturbation ou la dérégulation d’ATP13A2 a été associée à des phénotypes neurodégénératifs, avec des liens récurrents avec un parkinsonisme à début juvénile et des défauts de type maladie de surcharge lysosomale observés dans des modèles cellulaires. En conséquence, ATP13A2 est largement étudiée pour son rôle dans la vulnérabilité neuronale, l’élimination de protéines sujettes à l’agrégation et les réseaux de signalisation endolysosomaux.

ATP13A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP13A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP13A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP13A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP13A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP13A2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP13A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP13A2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP13A2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP13A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.