ASH1L CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402901-ACT

ASH1L (absent, small, or homeotic discs 1-like) kodiert eine nukleäre Histon-Lysin-Methyltransferase, die H3K36-Methylierungen anbringt, um die Transkriptionselongation zu unterstützen und zelltypspezifische Genexpressionsprogramme aufrechtzuerhalten. Über seine Chromatin-Reader- und katalytischen Domänen trägt ASH1L dazu bei, das Gleichgewicht zwischen Polycomb-vermittelter Repression und Aktivierung an Entwicklungs-Loci zu regulieren, und beeinflusst dadurch Prozesse wie neuronale Differenzierung und Linienfestlegung. Die von ASH1L gesteuerte epigenetische Kontrolle überschneidet sich mit Signalwegen, die Chromatin-Remodeling, Enhancer-Aktivität und Transkriptionsfidelity steuern. Genetische Varianten oder eine Fehlregulation von ASH1L wurden mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und veränderten genregulatorischen Netzwerken in Verbindung gebracht, was ASH1L zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der chromatingesteuerten Transkription macht.

ASH1L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ASH1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASH1L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ASH1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ASH1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASH1L-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ASH1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASH1L-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASH1L-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ASH1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.