ASC/TMS1/PYCARD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400151-ACT

PYCARD codifica ASC (nota anche come TMS1), una proteina adattatrice citosolica che nuclea l’assemblaggio dell’inflammasoma e collega i recettori di riconoscimento dei pattern a monte all’attivazione delle caspasi infiammatorie. Attraverso i suoi domini PYD e CARD, ASC promuove la formazione degli “ASC specks”, facilitando l’attivazione della caspasi-1 e la successiva maturazione di IL-1β e IL-18, nonché la piroptosi dipendente da gasdermina D. La segnalazione dipendente da ASC si integra con vie dell’immunità innata, incluse NLRP3, AIM2 e piattaforme di inflammasoma correlate, plasmando la difesa antimicrobica e l’infiammazione sterile. Un’attività disregolata di PYCARD/ASC è stata implicata nei meccanismi di malattie infiammatorie e autoimmuni ed è spesso studiata in contesti di infezione, neuroinfiammazione e segnalazione immunitaria associata ai tumori.

ASC/TMS1/PYCARD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PYCARD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASC/TMS1/PYCARD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PYCARD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PYCARD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASC/TMS1/PYCARD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PYCARD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASC/TMS1/PYCARD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASC/TMS1/PYCARD nelle cellule tumorali con espressione di PYCARD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.