Artemis Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-405295-ACT-2

Il gene umano DCLRE1C codifica Artemis, una nucleasi del DNA essenziale per la riparazione delle rotture a doppio filamento durante la ricombinazione V(D)J e il non-homologous end joining (NHEJ), in cui coopera con il complesso DNA-PK per aprire le estremità codificanti a forcina e processare i terminali danneggiati. L’attività di Artemis sostiene la stabilità del genoma e il corretto sviluppo dei linfociti, consentendo un’assemblaggio accurato dei geni dei recettori dell’antigene e risolvendo lesioni complesse del DNA generate da radiazioni ionizzanti o stress replicativo. Varianti con perdita di funzione in DCLRE1C sono associate a immunodeficienza combinata severa e radiosensibilità, evidenziando il suo ruolo all’intersezione tra immunità adattativa e segnalazione della risposta al danno al DNA. Studi di gene editing e di genomica funzionale mirati a DCLRE1C/Artemis vengono utilizzati per modellare difetti della via NHEJ, indagare i requisiti di processamento delle estremità nella riparazione delle rotture a doppio filamento e valutare gli effetti su riarrangiamenti cromosomici e formazione del repertorio immunitario nelle cellule umane.

Artemis Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DCLRE1C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Artemis Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DCLRE1C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DCLRE1C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Artemis. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DCLRE1C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Artemis nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Artemis nelle cellule tumorali con espressione di DCLRE1C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.