ARK-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401568-ACT

AURKA codiert die Serin/Threonin-Kinase ARK-1 (human), einen centrosomenassoziierten Regulator, der für den Eintritt in die Mitose, die Reifung des Centrosoms und den Aufbau einer bipolaren Spindel essenziell ist. ARK-1 koordiniert den Zellzyklusfortschritt durch Phosphorylierung von Spindel- und mikrotubuliassoziierten Substraten und ist in die Kontrolle des mitotischen Checkpoints eingebunden, um eine zuverlässige Chromosomensegregation sicherzustellen. Eine fehlregulierte AURKA-Aktivität beeinträchtigt die genomische Stabilität und wird in der Tumorbiologie häufig mit proliferativen Phänotypen und Aneuploidie in Verbindung gebracht. Als zentraler Knotenpunkt in mitosebezogenen Signalwegen wird AURKA häufig genutzt, um Mechanismen der Centrosomenamplifikation, der Spindeldynamik und von Stressantworten während der Zellteilung zu untersuchen.

ARK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AURKA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AURKA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AURKA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARK-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AURKA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARK-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARK-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AURKA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.