APPL2 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-432068-ACT-2

Mouse Appl2 codifica APPL2, una proteina adattatrice endosomiale contenente domini BAR, PH e PTB che collega gli endosomi precoci positivi per Rab5 alla trasduzione del segnale e al traffico di membrana. APPL2 coordina l’endocitosi mediata da recettori con vie a valle, tra cui la segnalazione PI3K–AKT e MAPK, influenzando la dinamica del citoscheletro, la migrazione cellulare e le risposte ai fattori di crescita. Alterazioni della segnalazione della famiglia APPL sono state associate alla regolazione del metabolismo, alla sensibilità all’insulina e a reti di segnalazione correlate al cancro, rendendo Appl2 un bersaglio rilevante per studiare il controllo della omeostasi cellulare dipendente dagli endosomi. L’editing genetico di Appl2 in sistemi murini consente l’analisi meccanicistica delle funzioni di impalcatura endocitica, del crosstalk tra vie di segnalazione e delle relazioni genotipo–fenotipo nella biologia cellulare e nella ricerca su modelli di malattia.

APPL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Appl2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

APPL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Appl2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Appl2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di APPL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Appl2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da APPL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via APPL2 nelle cellule tumorali con espressione di Appl2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.