Plásmido CRISPR de Activación (h) AOF1: sc-405078-ACT

La KDM1B (AOF1) humana codifica una desmetilasa de lisina dependiente de FAD que elimina de forma preferente las marcas H3K4me1/2 para moldear la accesibilidad de la cromatina y la salida transcripcional. Al modular los estados de metilación de las histonas, AOF1 contribuye a la regulación epigenética de programas de identidad celular, incluida la diferenciación, la estabilidad del genoma y el control transcripcional de la línea germinal o de etapas tempranas del desarrollo. La actividad de KDM1B se integra con redes más amplias de remodelación de la cromatina y de represión/activación transcripcional, e influye en vías que regulan la proliferación y el compromiso de linaje. La desregulación de la desmetilación de histonas y los patrones alterados de expresión de KDM1B se han asociado con el desequilibrio epigenético observado en múltiples contextos relevantes para la enfermedad, incluidos el cáncer y fenotipos del desarrollo.

AOF1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KDM1B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AOF1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KDM1B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KDM1B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AOF1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KDM1B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AOF1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AOF1 en células tumorales con expresión de KDM1B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.