ANO2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-433990-ACT

Ano2 codifica a ANO2 (TMEM16B), um canal de cloreto ativado por cálcio que modula a excitabilidade de membrana ao acoplar sinais intracelulares de Ca2+ ao fluxo de Cl−. Em neurônios e epitélios sensoriais, a ANO2 contribui para a repolarização dependente de atividade, a amplificação de sinais e a adaptação da frequência de disparo, conectando a dinâmica de Ca2+ à homeostase iônica e ao processamento sináptico. Esse canal participa de programas de transdução de estímulos relevantes para a olfação e outras vias sensoriais, e alterações na função da ANO2 têm sido investigadas em contextos de hiperexcitabilidade neuronal e disfunção sensorial. Modelos murinos de Ano2 dão suporte a estudos mecanísticos sobre como a condutância aniônica ativada por Ca2+ influencia a fisiologia de circuitos e a sinalização celular.

ANO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ano2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ANO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ano2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ano2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ANO2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ano2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ANO2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ANO2 em células tumorais com expressão de Ano2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.