Aminoacylase-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408464-ACT

ACY1 codifica a aminoacilase-1, uma hidrolase citosólica dependente de zinco que catalisa a desacetilação de N-acil-L-aminoácidos para gerar aminoácidos livres e acetato. Essa atividade sustenta o reaproveitamento de aminoácidos e o metabolismo do nitrogênio e pode influenciar os pools intracelulares de substratos que se cruzam com vias metabólicas mais amplas e com vias de proteostase. A aminoacilase-1 também está implicada no processamento de derivados de aminoácidos acetilados que surgem da renovação de peptídeos, vinculando sua função à homeostase celular sob estresse metabólico. Alterações na expressão de ACY1 foram relatadas em múltiplos contextos de doença, incluindo reprogramação metabólica associada ao câncer e erros inatos envolvendo o metabolismo de aminoácidos, o que a torna um nó útil para estudos mecanísticos.

Aminoacylase-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ACY1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Aminoacylase-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ACY1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ACY1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Aminoacylase-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ACY1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Aminoacylase-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Aminoacylase-1 em células tumorais com expressão de ACY1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.