AMIGO2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403312-ACT

AMIGO2 (Adhäsionsmolekül mit Ig-ähnlicher Domäne 2) ist ein Typ‑I‑Transmembranprotein der Zelloberfläche aus der AMIGO‑Familie, das Zell‑Zell‑Interaktionen, Neuritenauswachsung und Axonführung während der Entwicklung des Nervensystems unterstützt. In menschlichen Zellen wird AMIGO2 mit der Regulation adhäsionsabhängiger Signalwege, von Migration sowie von Überlebensprogrammen in Verbindung gebracht, die mit Zytoskelett‑Remodeling und rezeptorvermittelten Signalwegen zusammenlaufen. Eine veränderte AMIGO2‑Expression wurde in Zusammenhängen von Tumorprogression und metastaseassoziierten Phänotypen beschrieben, bei denen Änderungen von Adhäsion und Motilität die Gewebearchitektur umgestalten können. Diese Eigenschaften machen AMIGO2 zu einem nützlichen Ziel, um zu untersuchen, wie extrazelluläre Signale mit intrazellulärer Signalübertragung und Differenzierungszuständen gekoppelt sind.

AMIGO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AMIGO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMIGO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AMIGO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AMIGO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMIGO2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AMIGO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMIGO2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMIGO2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AMIGO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.