ALP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401877-ACT

PDLIM3 codifica ALP (actinin-associated LIM protein), una proteina scaffold della famiglia PDZ-LIM che si localizza al disco Z nel muscolo striato e collega l’organizzazione del citoscheletro ai processi di segnalazione. Legandosi all’α-actinina e a complessi associati all’actina, ALP contribuisce a coordinare l’assemblaggio del sarcomero, la meccanotrasduzione e i programmi di controllo della qualità proteica che mantengono l’integrità delle miofibrille. Le perturbazioni della rete associata a PDLIM3 sono state collegate ad alterazioni della struttura e della funzione del muscolo cardiaco e scheletrico, a sostegno di ulteriori studi su vie rilevanti per cardiomiopatie e miopatie. In modelli cellulari e tissutali, la modulazione dell’espressione di ALP è comunemente usata per analizzare risposte allo stress, rimodellamento del citoscheletro e stati di differenziamento muscolare.

ALP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDLIM3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ALP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDLIM3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDLIM3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ALP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDLIM3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ALP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ALP nelle cellule tumorali con espressione di PDLIM3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.