Akt1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419071-ACT

Mouse Akt1 kodiert AKT1, eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Effektor der PI3K-Signalgebung wirkt und das Überleben von Zellen, den Glukosestoffwechsel, die Proteinsynthese sowie den Fortschritt des Zellzyklus koordiniert. Nach Aktivierung nachgeschaltet von Rezeptor-Tyrosinkinasen sowie Insulin-/IGF-Signalwegen phosphoryliert AKT1 Zielproteine, die die mTORC1-Aktivität, FOXO-Transkriptionsfaktoren und GSK3-abhängige Prozesse regulieren, und prägt damit anaboles Wachstum und Stressantworten. Die Akt1-Aktivität beeinflusst zudem über Cross-Talk mit MAPK- und Fokaladhäsions-Signalwegen den Umbau des Zytoskeletts und die Zellmigration. Eine fehlregulierte AKT1-Signalgebung wird breit mit onkogenen Wachstumsprogrammen, Insulinresistenz und entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht und macht Akt1 zu einem wichtigen Knotenpunkt für die Analyse von Signalwegen in Maus-Krankheitsmodellen.

Akt1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Akt1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Akt1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Akt1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Akt1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Akt1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Akt1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Akt1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Akt1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Akt1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.