Plásmido CRISPR de Activación (h2) AGPS: sc-404604-ACT-2

El gen humano AGPS (alquilglicerona fosfato sintasa) codifica una enzima peroxisomal que cataliza un paso comprometido de la biosíntesis de fosfolípidos éter (plasmalógenos) al convertir acil-dihidroxiacetona fosfato en alquil-dihidroxiacetona fosfato, contribuyendo así a la composición de las membranas y a la señalización mediada por lípidos. La actividad de AGPS conecta el metabolismo lipídico dependiente de peroxisomas con vías más amplias que regulan las respuestas al estrés oxidativo, la homeostasis de los orgánulos y la remodelación lipídica a través de interfaces entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias. La alteración de la función de AGPS se ha implicado en trastornos de biogénesis peroxisomal y de deficiencia de plasmalógenos, incluidos los fenotipos del espectro de la condrodisplasia punctata rizomélica, lo que la convierte en una diana relevante para estudiar mecanismos de patología neurodel desarrollo y esquelética. La edición génica o la perturbación de AGPS es útil para generar modelos celulares con los que investigar el flujo lipídico peroxisomal, la dinámica de membranas dependiente de plasmalógenos y los efectos posteriores sobre la fisiología y el metabolismo celulares.

AGPS El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AGPS sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AGPS El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AGPS en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AGPS, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AGPS. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AGPS y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AGPS en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AGPS en células tumorales con expresión de AGPS silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.