Plasmide CRISPR d'Activation (h) Adducin α: sc-401693-ACT

Le gène humain ADD1 code l’adducine alpha, une protéine du cytosquelette membranaire qui coiffe et regroupe les filaments d’actine et favorise l’assemblage du réseau spectrine–actine à la membrane plasmique. En régulant le remodelage du cytosquelette, la stabilité des jonctions cellule–cellule et l’organisation membranaire, ADD1 contribue à l’intégrité des érythrocytes ainsi qu’au contrôle plus général de la forme et de la motilité cellulaires. La phosphorylation de l’adducine par des kinases telles que la PKC et des voies de signalisation associées à Rho module son affinité pour l’actine et la spectrine, la reliant à un contrôle dynamique de l’architecture corticale. Des perturbations génétiques et fonctionnelles d’ADD1 ont été associées à des altérations de la stabilité membranaire et à des phénotypes de signalisation, pertinents pour l’étude de la biologie vasculaire, des loci de risque d’hypertension et des mécanismes liés au cytosquelette dans les maladies complexes.

Adducin α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Adducin α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Adducin α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Adducin α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Adducin α dans les cellules tumorales présentant une expression de ADD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.