AATK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408483-ACT

AATK (apoptoseassoziierte Tyrosinkinase), auch bekannt als Lemur-Tyrosinkinase 1, ist eine Serin/Threonin-Kinase, die an der neuronalen Differenzierung, dem Neuritenwachstum und der Regulation apoptotischer Signalwege beteiligt ist. In menschlichen Zellen ist die AATK-Aktivität mit MAPK-assoziierter Signalübertragung und Programmen des zytoskelettalen Umbaus verknüpft, die Zellschicksalsentscheidungen prägen, darunter Wachstumsarrest und Überleben unter Stress. Veränderungen der Expression und funktionelle Störungen von AATK wurden mit veränderten Differenzierungszuständen und fehlregulierten Zelltodprogrammen in Verbindung gebracht – Prozesse, die häufig in Modellsystemen der Neurobiologie und Krebszellforschung untersucht werden. Als kinasespezifischer Regulator transkriptioneller und struktureller Programme stellt AATK einen gut untersuchbaren Knotenpunkt dar, um Mechanismen zu analysieren, die Signalübertragung mit Linienfestlegung und Stressantworten koppeln.

AATK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AATK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AATK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AATK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AATK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AATK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AATK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AATK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AATK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AATK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.