γ-GCSm Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418078-ACT

GCLM codifica a subunidade modificadora da ligase glutamato-cisteína (γ-GCSm), um componente-chave da enzima limitante da velocidade na biossíntese de glutationa (GSH). Ao modular a eficiência catalítica e a sensibilidade ao feedback do holoenzima, a γ-GCSm ajuda a controlar o tamponamento redox intracelular, a capacidade de desintoxicação e a homeostase de tióis. Essa função relaciona o GCLM às respostas ao estresse oxidativo e a programas transcricionais antioxidantes regulados por NRF2, influenciando a suscetibilidade a xenobióticos e a espécies reativas de oxigênio. Alterações na atividade ou na expressão de GCLM têm sido associadas na literatura a desequilíbrio redox relevante para estados inflamatórios, neurodegeneração, disfunção metabólica e adaptação ao estresse relacionada ao câncer.

γ-GCSm O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GCLM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

γ-GCSm O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GCLM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GCLM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de γ-GCSm. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GCLM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de γ-GCSm no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via γ-GCSm em células tumorais com expressão de GCLM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.