Plásmido CRISPR de Activación (h) γ-GCSc: sc-401133-ACT

GCLC codifica la subunidad catalítica de la ligasa de glutamato–cisteína (γ-GCSc), la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de novo del glutatión, que une glutamato y cisteína para formar γ-glutamilcisteína. Al controlar la disponibilidad de glutatión en la célula, γ-GCSc regula la homeostasis redox, la capacidad de desintoxicación y la sensibilidad al estrés oxidativo y electrofílico. La expresión de GCLC está estrechamente vinculada a la señalización antioxidante NRF2/KEAP1 y se interconecta con vías que gobiernan la ferroptosis, la función mitocondrial y las respuestas inflamatorias al estrés. La desregulación del metabolismo del glutatión y la alteración de la actividad de GCLC se han asociado con la adaptación redox en cáncer, la neurodegeneración, las enfermedades metabólicas y la susceptibilidad al daño por xenobióticos, lo que lo convierte en un nodo clave para estudios mecanísticos.

γ-GCSc El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GCLC sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

γ-GCSc El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GCLC en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GCLC, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de γ-GCSc. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GCLC y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de γ-GCSc en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía γ-GCSc en células tumorales con expresión de GCLC silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.