β6 Tubulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400062-ACT

TUBB6 codifica la β6-tubulina umana, una subunità centrale dell’eterodimero α/β-tubulina che polimerizza in microtubuli per sostenere l’architettura cellulare, il trasporto intracellulare e la formazione del fuso mitotico. Attraverso l’instabilità dinamica, la β6-tubulina contribuisce al rimodellamento del citoscheletro che coordina il traffico vescicolare, il posizionamento degli organelli e la segregazione dei cromosomi. La regolazione dei microtubuli si interseca con vie che controllano la progressione del ciclo cellulare, la polarità e le risposte allo stress, e alterazioni nella composizione o nell’espressione delle tubuline possono influenzare la dinamica dei microtubuli. Un comportamento disfunzionale dei microtubuli è associato a fenotipi proliferativi e neurobiologici, rendendo TUBB6 un nodo utile per studiare i meccanismi di malattia legati al citoscheletro.

β6 Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TUBB6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β6 Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TUBB6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TUBB6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β6 Tubulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TUBB6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β6 Tubulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β6 Tubulin nelle cellule tumorali con espressione di TUBB6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.