αENaC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401123-ACT

SCNN1A kodiert die Alpha‑Untereinheit des epithelialen Natriumkanals (αENaC), einen entscheidenden Determinanten des apikalen Na⁺‑Einstroms in polarisierten Epithelien. Zusammen mit den β‑ und γ‑ENaC‑Untereinheiten ermöglicht αENaC die transepitheliale Natriumresorption und die nachgeschaltete osmotische Wasserbewegung und beeinflusst damit die Homöostase der Flüssigkeit auf der Atemwegsoberfläche, die renale Natriumhandhabung sowie die Physiologie der epithelialen Barriere. Die ENaC‑Aktivität wird streng durch proteolytische Prozessierung und ubiquitinabhängigen Turnover über den NEDD4L‑Signalweg reguliert und integriert dabei Signale aus der Aldosteron/MR‑Signalgebung und der Lipidzusammensetzung der Zellmembran. Eine veränderte SCNN1A‑Expression oder ENaC‑Regulation ist mit Störungen des Salz‑ und Flüssigkeitshaushalts verbunden, darunter Mukoviszidose‑assoziierte Phänotypen mit Dehydratation der Atemwege sowie monogene Syndrome, die die Blutdruckregulation betreffen.

αENaC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SCNN1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

αENaC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SCNN1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SCNN1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen αENaC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SCNN1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von αENaC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des αENaC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SCNN1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.