Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS45: sc-411599-ACT

VPS45 code un régulateur conservé de la famille Sec1/Munc18 du trafic vésiculaire, qui coordonne les événements de fusion membranaire dépendants des SNARE nécessaires au transport des endosomes vers l’appareil de Golgi et à la maturation endosomale. Dans les cellules humaines, VPS45 contribue à la stabilité et à la fonction de la machinerie d’arrimage apparentée à HOPS/CORVET et aide à maintenir le tri du cargo, le recyclage des récepteurs et le trafic dirigé vers les lysosomes. La perturbation du trafic dépendant de VPS45 dérègle l’homéostasie des organites, affecte les voies autophagie–lysosome et peut modifier la signalisation en changeant la disponibilité des récepteurs à la membrane plasmique. Des études génétiques et fonctionnelles établissent un lien entre le dysfonctionnement de VPS45 et des phénotypes immunitaires et hématopoïétiques, ce qui en fait une cible pertinente pour la recherche mécanistique sur les défauts de transport intracellulaire et leurs conséquences cellulaires en aval.

VPS45 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS45 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS45 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS45 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS45, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS45. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS45 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS45 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS45 dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS45 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.