UBC13 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417204-ACT

O UBE2N humano codifica a enzima E2 conjugadora de ubiquitina UBC13, um catalisador central da poliubiquitinação ligada a Lys63 (K63), que molda saídas de sinalização não proteolíticas. Em complexo com cofatores UEV como UBE2V1/UBE2V2, a UBC13 promove a montagem de cadeias de ubiquitina K63 que coordenam respostas a danos no DNA, tolerância ao estresse de replicação e sinalização imune inata. Essa atividade é central para a ativação de vias como NF-κB e MAPK a jusante de receptores como TNFR e receptores Toll-like, e influencia a dinâmica de complexos proteicos em vez da degradação pelo proteassoma. A sinalização de ubiquitina dependente de UBE2N/UBC13, quando desregulada, tem sido implicada em estados inflamatórios alterados, defeitos na estabilidade genômica e reprogramação de vias oncogênicas, tornando-a relevante para estudos mecanísticos em biologia do câncer e imunologia.

UBC13 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UBE2N sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UBC13 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UBE2N em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UBE2N, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UBC13. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UBE2N nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UBC13 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UBC13 em células tumorais com expressão de UBE2N silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.