Tropomyosin γ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425595-ACT

Tpm3 kodiert Tropomyosin γ, ein aktinbindendes Coiled-Coil-Protein, das entlang von filamentösem Aktin polymerisiert, um Mikrofilamente zu stabilisieren und die Interaktionen mit Myosinmotoren fein abzustimmen. In Mauszellen tragen TPM3-haltige Tropomyosin-Isoformen dazu bei, die Identität von Aktinfilamenten zu definieren, und beeinflussen dadurch die Organisation von Stressfasern, die Dynamik fokaler Adhäsionen, die Zellform und die Mechanotransduktion. Über diese Funktionen ist Tpm3 an Prozessen des Zytoskelett-Remodelings beteiligt, die Zellmigration, intrazellulären Transport und Differenzierungsprogramme in Muskel- und Nichtmuskelkontexten prägen. Eine veränderte Expression oder Regulation von TPM3-Isoformen wurde in der Literatur mit zytoskelettassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Entwicklungsbiologie- und Krankheitsmodelle relevant sind, darunter Veränderungen in Signalnetzwerken für Adhäsion und Motilität.

Tropomyosin γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tpm3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tropomyosin γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tpm3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tpm3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tropomyosin γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tpm3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tropomyosin γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tropomyosin γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tpm3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.