Treacle Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403067-ACT

Il gene umano **TCOF1** codifica per la **treacle**, una fosfoproteina nucleolare essenziale per la biogenesi dei ribosomi e per lo sviluppo della cresta neurale. Treacle partecipa alla trascrizione del rDNA e al processamento del pre-rRNA e coordina le risposte allo stress nucleolare attraverso interazioni con fattori associati alla RNA polimerasi I. L’alterazione di **TCOF1** compromette l’omeostasi del nucleolo, influenza la segnalazione di stress mediata da p53 e modifica i programmi di proliferazione e differenziamento. Varianti patogene in **TCOF1** sono associate alla sindrome di Treacher Collins, rendendo la regolazione di **TCOF1** rilevante per gli studi sullo sviluppo craniofacciale e sulle ribosomopatie.

Treacle Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TCOF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Treacle Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TCOF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TCOF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Treacle. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TCOF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Treacle nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Treacle nelle cellule tumorali con espressione di TCOF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.