Plásmido CRISPR de Activación (m) TFEB: sc-437332-ACT

Mouse Tfeb codifica el factor de transcripción EB (TFEB), un regulador básico de hélice–bucle–hélice con cremallera de leucina que coordina la biogénesis lisosomal y la autofagia a través de la red génica CLEAR. TFEB integra señales de nutrientes y de estrés aguas abajo de mTORC1 y de vías de quinasas relacionadas para controlar la función lisosomal, el tráfico endolisosomal y la proteostasis celular. La actividad alterada de TFEB se ha vinculado con la desregulación de las vías de autofagia-lisosoma implicadas en la neurodegeneración, la disfunción metabólica y fenotipos similares a los de las enfermedades de almacenamiento lisosomal, lo que lo convierte en un nodo clave para estudios mecanísticos de los programas celulares de depuración.

TFEB El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Tfeb sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TFEB El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Tfeb en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Tfeb, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TFEB. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Tfeb y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TFEB en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TFEB en células tumorales con expresión de Tfeb silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.