TACE/ADAM17 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400827-ACT

ADAM17, noto anche come TACE, è una metalloproteasi ancorata alla membrana che catalizza lo shedding dell’ectodominio di numerosi substrati, tra cui TNF-α, ligandi di EGFR (come amfiregulina e TGF-α) e diverse molecole di adesione. Attraverso una proteolisi regolata sulla superficie cellulare, TACE/ADAM17 integra la segnalazione infiammatoria con vie dipendenti dai fattori di crescita, incluse EGFR–MAPK/ERK e NF-κB, modulando il rilascio di citochine, l’attivazione dei recettori e il rimodellamento tissutale. Un’attività di ADAM17 deregolata è stata associata a infiammazione cronica e a reti di segnalazione legate al cancro, ed è ampiamente studiata per il suo ruolo nella comunicazione tra cellule immunitarie, nell’omeostasi epiteliale e nel crosstalk del microambiente.

TACE/ADAM17 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADAM17 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TACE/ADAM17 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADAM17 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADAM17, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TACE/ADAM17. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADAM17 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TACE/ADAM17 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TACE/ADAM17 nelle cellule tumorali con espressione di ADAM17 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.