Plasmide CRISPR d'Activation (h) SphK1: sc-401274-ACT

Le gène humain **SPHK1** code la sphingosine kinase 1 (SphK1), une kinase lipidique cytosolique qui phosphoryle la sphingosine pour produire la sphingosine-1-phosphate (S1P), un sphingolipide bioactif reliant l’état métabolique aux sorties de signalisation. En déplaçant le « rhéostat » des sphingolipides vers la S1P, SphK1 influence le trafic membranaire, la signalisation dépendante du calcium et l’activité en aval des voies MAPK/ERK, PI3K/AKT et NF-κB, via des actions intracellulaires et une signalisation dépendante des récepteurs de la S1P. La régulation de **SPHK1** a été associée aux réponses inflammatoires, à l’adaptation au stress, à la signalisation angiogénique et aux programmes de motilité cellulaire dans divers contextes cellulaires. Une signalisation **SPHK1/S1P** altérée est fréquemment étudiée en biologie du cancer, dans la fibrose et dans des modèles de maladies immuno-médiées, où le remodelage des sphingolipides affecte la prolifération, la survie et la communication avec le microenvironnement.

SphK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPHK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SphK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPHK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPHK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SphK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPHK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SphK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SphK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPHK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.