Plasmide CRISPR d'Activation (h) SMPDL3B: sc-404724-ACT

Le gène humain SMPDL3B (sphingomyelin phosphodiesterase acid-like 3B) code une protéine associée à la membrane et ancrée par GPI, présentant une homologie avec des enzymes apparentées aux sphingomyélinases, et impliquée dans la régulation de l’homéostasie des sphingolipides et des lipides membranaires. En influençant la composition lipidique et l’organisation des microdomaines, SMPDL3B peut moduler la signalisation des récepteurs, le trafic vésiculaire et les sorties de signalisation de l’immunité innée dans les cellules myéloïdes et d’autres types cellulaires. Une expression altérée de SMPDL3B a été associée dans la littérature à des phénotypes immunitaires et inflammatoires, et a été étudiée dans des contextes tels que la biologie des maladies rénales et métaboliques, où le remodelage lipidique et la signalisation immunitaire se recoupent. Ces caractéristiques font de SMPDL3B une cible utile pour étudier les mécanismes de signalisation proximaux à la membrane et la régulation, par les lipides, des états d’activation cellulaire.

SMPDL3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SMPDL3B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SMPDL3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SMPDL3B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SMPDL3B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SMPDL3B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SMPDL3B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SMPDL3B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SMPDL3B dans les cellules tumorales présentant une expression de SMPDL3B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.