Sec8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405009-ACT

L’EXOC4 umano codifica Sec8, una componente centrale del complesso esocista ottamerico che ancora le vescicole secretorie post-Golgi alla membrana plasmatica prima della fusione di membrana dipendente dagli SNARE. Sec8 sostiene l’esocitosi polarizzata, la consegna di proteine di membrana e il coordinamento del citoscheletro, collegando il traffico vescicolare con la migrazione cellulare, la crescita dei neuriti e i programmi di polarità epiteliale. Attraverso il traffico dipendente dall’esocista, EXOC4 influenza la segnalazione e la disponibilità dei recettori sulla superficie cellulare, con effetti a valle sulla risposta ai fattori di crescita e sul mantenimento delle giunzioni cellula–cellula. La deregolazione della funzione dell’esocista, inclusa un’attività alterata di EXOC4/Sec8, è stata associata a difetti di secrezione e di polarità, spesso studiati nel contesto del comportamento invasivo e di altri fenotipi cellulari complessi rilevanti per la malattia.

Sec8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EXOC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sec8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EXOC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EXOC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sec8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EXOC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sec8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sec8 nelle cellule tumorali con espressione di EXOC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.