Sar1B Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425994-ACT

Sar1b codifica la piccola GTPasi SAR1B, un regolatore chiave della biogenesi delle vescicole rivestite da COPII nei siti di uscita dal reticolo endoplasmatico. Alternando gli stati legati a GDP e a GTP, SAR1B avvia la curvatura della membrana e recluta i componenti del COPII per controllare il traffico dal RE al Golgi di proteine secretorie e di membrana, inclusi i carichi associati alle lipoproteine. Il trasporto dipendente da Sar1b si integra con la proteostasi del RE, la gestione dei lipidi e la risposta alle proteine non correttamente ripiegate, rendendolo rilevante per studi sull’assorbimento intestinale dei lipidi, sulla secrezione degli epatociti e sull’omeostasi metabolica. L’alterazione della funzione di SAR1B è collegata a difetti nell’esportazione dei chilomicroni e nella distribuzione sistemica dei lipidi, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in modelli di dislipidemia e stress degli organelli.

Sar1B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sar1b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sar1B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sar1b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sar1b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sar1B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sar1b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sar1B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sar1B nelle cellule tumorali con espressione di Sar1b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.