Plásmido CRISPR de Activación (m) Rubicon: sc-432438-ACT

El gen murino 1700021K19Rik codifica Rubicon (proteína que contiene un dominio RUN y un dominio rico en cisteínas e interacciona con Beclin 1), un regulador del tráfico de membranas que modula la autofagia y la maduración endolisosomal. Rubicon es conocido principalmente por restringir la fusión entre el autofagosoma y el lisosoma mediante interacciones con el complejo PI3K de clase III de Beclin 1–VPS34, y por influir en la fagocitosis asociada a LC3, dando forma a la degradación lisosomal, la inflamación y las respuestas celulares al estrés. Al controlar el flujo a través de las vías de autofagia y fagocitosis, Rubicon puede afectar el control de calidad mitocondrial, la defensa antimicrobiana y los programas de producción de citocinas relevantes para la neurodegeneración, la disfunción metabólica y la patología mediada por el sistema inmunitario. Estas funciones hacen de Rubicon un nodo útil para analizar cómo el tráfico vesicular y el recambio dependiente de lisosomas gobiernan la homeostasis en diversos tipos celulares de ratón.

Rubicon El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de 1700021K19Rik sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rubicon El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus 1700021K19Rik en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional 1700021K19Rik, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rubicon. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo 1700021K19Rik y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rubicon en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rubicon en células tumorales con expresión de 1700021K19Rik silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.