Rho T1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401601-ACT

RHOT1 codifica a Rho T1 (Miro1), uma GTPase atípica da família Rho ancorada à membrana externa da mitocôndria, que coordena o tráfego, o posicionamento e o controle de qualidade mitocondrial. Por meio de domínios EF-hand de ligação a Ca2+ e de interações com adaptadores de cinesina/dineína, RHOT1 ajuda a acoplar as mitocôndrias ao transporte baseado em microtúbulos e regula a dinâmica mitocondrial, a homeostase bioenergética e a mitofagia, incluindo vias associadas a PINK1/PRKN. A desregulação da função de RHOT1 tem sido associada à distribuição mitocondrial alterada e à renovação deficiente de organelas, processos implicados em neurodegeneração, neuropatias e outros distúrbios com fenótipos de estresse mitocondrial. Como regulador do transporte mitocondrial, RHOT1 é frequentemente estudado em modelos neuronais, em paradigmas de estresse oxidativo e em ensaios de integridade da rede mitocondrial e de respiração.

Rho T1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RHOT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rho T1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RHOT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RHOT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rho T1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RHOT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rho T1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rho T1 em células tumorais com expressão de RHOT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.