Raf-1 Plasmide Double Nickase (h): sc-400202-NIC

RAF1 codifica la chinasi serina/treonina Raf-1, un effettore centrale della segnalazione di RAS che trasmette gli input provenienti dalle tirosin-chinasi recettoriali attivate alla cascata MAPK/ERK. Raf-1 regola la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione, l'apoptosi e le risposte allo stress attraverso la fosforilazione di chinasi a valle, tra cui MEK1/2, e la conseguente attivazione di ERK1/2. Un'attività deregolata di RAF1 e una segnalazione aberrante della via MAPK sono implicate nella trasformazione oncogenica e in meccanismi di resistenza; inoltre, alterazioni germinali o somatiche di RAF1 sono state collegate a sindromi dello sviluppo e a difetti di segnalazione associati a cardiomiopatia. In quanto hub di segnalazione che integra segnali di fattori di crescita e stimoli infiammatori, Raf-1 è ampiamente studiata per il crosstalk con PI3K-AKT, per la regolazione tramite feedback e per il controllo dell'attività chinasica mediato da fosfatasi.

Raf-1 Il plasmide Double Nickase (h) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus RAF1 nelle linee cellulari human. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di RAF1. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di RAF1. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con RAF1 interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.