Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLU-1: sc-403771-ACT

KDM5B code pour PLU-1 (JARID1B), une déméthylase des lysines d’histones contenant un domaine Jumonji C (JmjC), qui enlève préférentiellement les marques H3K4me3/2, remodelant ainsi la chromatine associée aux promoteurs et les programmes transcriptionnels. Par ses interactions avec des facteurs de transcription spécifiques de lignée et des complexes de remodelage de la chromatine, PLU-1 contribue à la régulation de la progression du cycle cellulaire, des états de différenciation et du maintien de la chromatine lié à la réplication. Une activité altérée de KDM5B a été associée à une plasticité épigénétique et à une reprogrammation transcriptionnelle dans de multiples contextes tumoraux, ce qui en fait une cible largement utilisée pour étudier le contrôle de la prolifération et de l’identité cellulaire dépendant de la chromatine. Dans des modèles cellulaires humains, la perturbation de PLU-1 aide à disséquer les voies reliant la dynamique de méthylation des histones aux profils d’expression génique et aux transitions phénotypiques.

PLU-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KDM5B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLU-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KDM5B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KDM5B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLU-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KDM5B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLU-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLU-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KDM5B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.