Plasmide CRISPR d'Activation (m) PKC lambda/iota: sc-422263-ACT

Prkci code l’isoforme atypique de la protéine kinase C, PKC lambda/iota, une kinase sérine/thréonine qui constitue un composant central du complexe de polarité PAR et régule la polarité apico-basale, la division cellulaire asymétrique et l’organisation des jonctions serrées. Dans les cellules murines, PKC lambda/iota intègre des signaux en amont provenant de petites GTPases et de la signalisation des phosphoinositides afin de coordonner la dynamique du cytosquelette, le trafic vésiculaire et la migration directionnelle. Elle module les voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la survie via des circuits qui recoupent les sorties transcriptionnelles PI3K–AKT, NF-κB et Hippo/YAP, influençant la différenciation et l’architecture tissulaire. Un dérèglement de l’activité des PKC atypiques a été associé à une intégrité épithéliale altérée, à un contrôle de la croissance aberrant et à des phénotypes liés à l’inflammation, faisant de Prkci un nœud utile pour des études mécanistiques en développement, régénération et modèles de maladie.

PKC lambda/iota Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Prkci sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC lambda/iota Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Prkci dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Prkci, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC lambda/iota. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Prkci natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC lambda/iota au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC lambda/iota dans les cellules tumorales présentant une expression de Prkci silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.